作业帮Ni-NTA纯化问题,获得不了纯的目的蛋白!我们用的是导入质粒的大肠杆菌,然后用IPTG诱导,然后将细菌裂解.去掉细菌沉淀,上清过柱,然后用浓度为20mM,40mM,60mM,100mM,150mM,200mM的含有咪唑的洗脱液洗脱
来源：学生作业帮助网 编辑：作业帮 时间：2024/04/29 15:05:28
Ni-NTA纯化问题,获得不了纯的目的蛋白!我们用的是导入质粒的大肠杆菌,然后用IPTG诱导,然后将细菌裂解.去掉细菌沉淀,上清过柱,然后用浓度为20mM,40mM,60mM,100mM,150mM,200mM的含有咪唑的洗脱液洗脱
Ni-NTA纯化问题,获得不了纯的目的蛋白!
我们用的是导入质粒的大肠杆菌,然后用IPTG诱导,然后将细菌裂解.去掉细菌沉淀,上清过柱,然后用浓度为20mM,40mM,60mM,100mM,150mM,200mM的含有咪唑的洗脱液洗脱蛋白,20mM就有目的蛋白但是很杂,曾经缩小过咪唑的浓度,但是结果还是一样10mM也有目的蛋白,20mM的依然很杂,40mM的相对于20mM较纯,但也有一两条杂蛋白,60mM有时有目的蛋白有时没有,100mM几乎没有了以后的就都没有了.我们的目的蛋白分子量是30KDa左右,还总是由分解的蛋白,降低温度也没有什么效果,现在我很迷茫,我应该怎么处理,请前辈们,
Ni-NTA纯化问题,获得不了纯的目的蛋白!我们用的是导入质粒的大肠杆菌,然后用IPTG诱导,然后将细菌裂解.去掉细菌沉淀,上清过柱,然后用浓度为20mM,40mM,60mM,100mM,150mM,200mM的含有咪唑的洗脱液洗脱
这种情况在ni柱纯化时经常出现,你基本的方法没错,问题的根本原因是蛋白与填料的亲和力不够强,没法很好的洗脱杂蛋白,给你如下建议：
1,如果可行,在你的重组蛋白两端各加一个His-tag,这意味着你需要3天-7天的时间重新调整载体,这样会大大增强其亲和力,再用咪唑梯度洗就可以在20mM左右洗杂蛋白,在50-100mM左右洗目的蛋白,能较好的分离杂蛋白与目的蛋白；
2,如果重新构建不可行,对于你的先行体系,建议如下：
适当延长诱导表达时间,以增加目的蛋白含量；
在用咪唑梯度洗之前,先过3-5倍柱体积的buffer,先洗掉一部分杂蛋白,填料要保证已处理充分,既没有上次剩余的蛋白也有足够ni；
不要用这么多的梯度,有一点你需要明白,根据你现在的结果来看,60mM的咪唑是足以洗脱你的目的蛋白,而你的杂蛋白主要在20mM以下就洗差不多了,所以,你用buffer洗后,直接用5-10mM咪唑（用20mM洗的更干净,但目的蛋白肯定损失多,先试10mM）洗3-5个柱体积,以去除杂蛋白,再直接用60mM洗脱目的蛋白（也有可能60mM洗不下,那就试100mM）.
这样做的策略就是：较低咪唑洗杂蛋白,再一次性用相对较高咪唑洗目的蛋白.洗杂蛋白的咪唑浓度越高,时间越长,你的蛋白就越纯,但同时目的蛋白的损失也更大,这就需要你自己摸索合适的咪唑浓度和时间,以取得你需要的蛋白纯度和浓度.
你的柱子吸附量过低或者上样时盐浓度过高。使得目的蛋白无法全部吸附上去。
而你在冲洗过程中，杂蛋白没冲干净，应该多冲一下。我们上样的时候是1200ml的菌液离心后用12ml的细菌裂解液裂解，然后上样，填料大概是7ml-10ml左右，柱子直接是15mm，会不会是柱子太细了？上样前我们都是用PBS平衡柱子的，应该用什么溶液好呢？洗脱的问题谢谢你，我再进一步实验具体用多少量！裂解液什么成分？ 是否...
全部展开
你的柱子吸附量过低或者上样时盐浓度过高。使得目的蛋白无法全部吸附上去。
而你在冲洗过程中，杂蛋白没冲干净，应该多冲一下。
收起