不用试剂盒如何纯化DNA?

不用试剂盒如何纯化DNA?
不用试剂盒如何纯化DNA?

不用试剂盒如何纯化DNA?
DNA纯化
首先利用琼胶电泳将不同分子量的DNA片段分开,将某一特定分子量区域的琼胶切下,利用DNA extraction kit将DNA从琼胶中溶出并浓缩.
实验材料
( 6X gel-loading dye:15% Ficoll 400,0.25% bromophenol blue,
0.25% xylene cyanol
( 紫外光箱
( 下列试剂来自GeneAid公司所售的Gel/PCR Fragment Extraction Kit:
* DF Buffer
* Wash Buffer
* Elution Buffer:10mM Tris-HCl(pH8.5)
* DF Column
* 2ml Collection Tube
实验步骤
A.将欲分离之DNA混合物以0.7%琼胶电泳分离.
B.电泳后,将琼胶置於紫外光箱上观察,把含有欲纯化之DNA片段的琼胶部位切下.
C.将步骤B的琼胶以蓝色微量吸管尽可能戳碎.
D.加入500ml DF buffer,55oC作用10分钟,每2-3分钟摇晃数次,直至琼胶完全溶解.
E.将步骤D琼胶溶液全部吸入DF Column,并套上Collection Tube(收集过滤液).
F.8000rpm离心1分钟,将过滤液倒掉.
G.加入500ml Wash Buffer,8000rpm离心1分钟,过滤液倒掉.
H.14000rpm离心2分钟.
I.将DF Column转移至上另一乾净的微量离心管.加入15ml Elution Buffer,室温静置2分钟.
J.14000rpm离心2分钟,微量离心管内之液体即为纯化的DNA片段.
K.取0.5ml纯化的DNA加入4.5mlDDW及1ml 6x DNA loading dye,跑0.7%琼胶电泳,与marker比较,估计DNA的浓度.

那要看你用什么方法测定DNA和RNA：
（1）紫外吸收法也就是测量OD（260）和OD（280）的吸收值，这样的方法其它的杂质对测量结果影响大一点，因为其它杂质在这两个吸收波长也有吸收。
（2）荧光法，用PicoGreen荧光染料，测定DNA，RNA浓度比较灵敏，并且适合测量低浓度和微量DNA和RNA，并且受其它杂质的影响不大，缺点要有专门的荧光检测仪器，试剂比较昂贵。

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那要看你用什么方法测定DNA和RNA：
（1）紫外吸收法也就是测量OD（260）和OD（280）的吸收值，这样的方法其它的杂质对测量结果影响大一点，因为其它杂质在这两个吸收波长也有吸收。
（2）荧光法，用PicoGreen荧光染料，测定DNA，RNA浓度比较灵敏，并且适合测量低浓度和微量DNA和RNA，并且受其它杂质的影响不大，缺点要有专门的荧光检测仪器，试剂比较昂贵。
纯化DNA可以买试剂盒，主要有膜吸附法，磁珠分离法，都很方便。
酶解法(纤维素酶,果胶酶)去除细胞壁;然后至于蒸馏水中,使其吸水胀破,
加热后冷却,用玻璃棒搅拌,会慢慢析出.
PUREGENE DNA提取试剂盒常见问题及解答
方法：
Q PUREGENE DNA提取试剂盒是建立在什么方法基础上的？
A PUREGENE DNA提取试剂盒是建立在一个改良的盐沉淀方法之上的。
Q 预期的A260／A280？
A 预期的A260／A280为1.7-2.0。
Q 提取的基因组DNA的预期长度为多少？
A 一般来说，提取的长度大于100kb，通常为100-200kb。
Q 有无试剂盒内溶液成分的说明？
A 除DNA溶解液外未向客户提供盒内溶液成分具体说明。
Q DNA溶解液的成分是什么？
A DNA溶解液的成分为100mM Tris，1mM EDTA，pH值为7.0-8.0。
保存：
Q PUREGENE试剂盒应在何种温度下保存？
A 所有成分室温下保存，但诸如RNase A溶液和溶菌酶（Lytic Enzyme Solution）之类的酶除外，需4
℃保存。
Q 细胞裂解液中有沉淀，还能使用吗？
A 如果在较冷的天气下或在低温下保存，细胞裂解液中的SDS可能形成沉淀，可将裂解液在37-65℃水
浴中加热直到沉淀溶解，混匀再使用。
Q RNase A在室温下可保存多久？
A RNase A在室温下至少可保存8周。
Q PUREGENE DNA提取试剂盒保质期为多长时间？
A 三年以上。
Q 提取的DNA可保存供以后使用吗？
A 可以的，PUREGENE DNA在4℃可稳定保存5年以上，在-20℃可长期保存。但应注意避免反复冻融
以减少DNA片段受损。
标本处理和操作方法：
Q Gentra公司推荐的血液标本收集管为何种类型？
A Gentra公司推荐使用EDTA管对血液标本进行收集，也可用ACD管。但是建议您不要使用含抗凝剂肝素
的收集管，因为肝素在PCR中可抑制Taq酶的活性。
Q 可以从冻存的血液标本中提取DNA吗？
A 可以的。Gentra建议将冻存的血样在37℃水浴中迅速解冻，使用前一直置于冰上以减少内源性DNase的
活性。然后，按全血中提取DNA的方法进行RBC裂解，将血样冻结后分成几部分提取是有效的措施。
Q 研究者可以用PUREGENE DNA提取试剂盒从血凝块中提取DNA吗？
A 可以。Gentra可提供从血凝块中提取DNA的操作方法。
Q 在开始的孵育过程中如果红细胞裂解不完全，可以重复红细胞裂解步骤吗？
A 可以。当标本中红细胞的含量过多时，可能会发生红细胞不完全裂解，这时可以重复红细胞裂解步
骤。
Q 当加入细胞裂解液后，在标本中有细胞凝集块，该怎么办？
A 凝集块的出现很可能是因为在加入细胞裂解液之前细胞未能彻底悬浮。解决方法：标本在细胞裂解液
中孵育，不时地振荡直至在37℃室温下将溶液混匀，或在标本中加入蛋白酶K（终浓度为100礸/ml），
55℃孵育直到细胞彻底地被裂解。
Q 在蛋白沉淀步骤中，如果离心后仍未见到蛋白沉淀，或蛋白沉淀很松散，该怎么办？
A 建议您在离心前将标本再次振荡20秒，并置于冰上5分钟。如果标本在加入蛋白沉淀液之前没有冷却
至室温或充分振荡20秒钟使得蛋白沉淀液和细胞裂解液未能充分混合，蛋白沉淀松散的情况就会出现。
Q 在蛋白沉淀步骤中振荡样品20秒钟会使DNA片段断裂吗？
A 不会的。PUREGENE方法是一种非常温和的改良的盐沉淀方法，与使用有害化学物质的有机溶解和柱式
方法相比，PUREGENE方法振荡引起断裂的DNA片段最少。
Q 可以从比说明书中所提及的标本更小或更大的标本中提取DNA吗？
A 可以的。因为PUREGENE可以根据标本量大小来升级、降级操作。
Q 可以通过真空离心法（speed-vac）干燥DNA吗？
A 不可以的。因为使用这种方法干燥DNA，标本很容易过度干燥而造成溶解困难。建议您将DNA在室
温下风干10-15分钟，使乙醇完全挥发，仅有水滴留在管壁，从而不会干扰下一步的DNA分析。
Q 怎样测定从标本中提取的DNA量 ？
A 分光光度测定法。Gentra可提供紫外定量的方法，具体方法参见说明书。
Q 如果A260／A280小于1.6，也就是DNA样本被蛋白质污染，该如何纯化DNA？
A 为了去除蛋白污染，DNA标本可按标准方法进一步纯化。蛋白质污染往往是由于起始标本量过多造成
的，因此需注意说明书中规定的起始标本量的范围。
Q 如果A260／A280大于2.0即存在RNA污染，该怎么办？
A 重复进行RNase A处理，对DNA重新沉淀，对含有大量RNA的标本，延长RNase A的处理时间（15
分钟到30-60分钟）直至RNA完全被去除。
Q 使用PUREGENE DNA提取试剂盒对DNA进行提取时，好的终止方法是什么？
A 好的终止方法为：
1. 当加入细胞裂解液后，大多数标本在室温下至少18个月内保持稳定。
2. 加入100％异丙醇的标本在室温下可长期保存。
Q 为什么实际提取的DNA产量比预期值低？
A 如果细胞未被完全裂解，会导致产量的降低。根据操作方法中的起始标本量进行加样非常重要。细胞量过少可能会使DNA提取的化学试剂产生不平衡，并抑制DNA的沉淀，细胞量过多使细胞不能完全裂解。在任一情况下，均会使DNA产量偏低。
Q 标本中细胞含量太低，估计会得到较低产量的DNA，获得最大量DNA的最佳方法是什么？
A 当从少于2×105万个细胞的标本中提取DNA或预期产量较低时，可将糖原加入异丙醇中作为DNA的载体。Gentra建议每600祃异丙醇中加入1祃糖原（20mg/ml）。
扩增：
Q 为什么通过PCR扩增无产物？
A 通过这种方法提取的DNA产量往往很高。但是，当过量的DNA加入PCR系统中可能使反应抑制。建议每50祃反应体积中加入25-1,000ngDNA，DNA体积不宜大于PCR反应体积的1／10。除此之外，可增加PCR体系中的MgCl2浓度。
Q 为什么DNA不被限制性内切酶完全消化？
A 常见原因是反应体系中加入的DNA过量，建议每微克DNA使用2U的限制性内切酶。
Q 纯化的DNA可以作PCR、Southerns或测序吗？
A 完全可以的。

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